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Dienstag, 12. Dezember 2017

Forschung

An der Grenze des Sichtbaren

Von Bettina Reckter | 16. Februar 2017 | Ausgabe 07

Was als unmöglich galt, ist nun gelungen – Wissenschaftler haben ein Lichtmikroskop entwickelt, mit dem sich erstmals Moleküle beobachten lassen, die nur wenige Nanometer auseinander liegen.

BU 1 Licht Mikroskop
Foto: Irene Böttcher-Gajewski / Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Erfinder am Werk: Nobelpreisträger Stefan Hell (v. li.) mit seinen Kollegen Francisco Balzarotti, Yvan Eilers und Klaus Gwosch am Supermikroskop.

Der Name ist Programm, könnte man meinen. Stefan Hell bringt Licht ins Dunkel – speziell in jene Bereiche, in denen längst das menschliche Auge und irgendwann eben auch die Technik kapituliert. Erneut hat der Physiker, der für seine Arbeiten 2014 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt wurde, die Auflösungsgrenze optischer Mikroskope ausgetrickst.

Generationen von Forschern hatten sich zuvor die Zähne daran ausgebissen, die Trennschärfe der Lichtmikroskopie so zu verbessern, dass sich beieinander liegende Moleküle einzeln abbilden lassen. Hell und seinem Team am Göttinger Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie ist nun genau das gelungen: Ihr Fluoreszenzmikroskop Minflux (minimal emission fluxes = minimale Emissionsflüsse) kann erstmals Moleküle unterscheiden, die nur wenige Nanometer voneinander entfernt sind.

Das neue Instrument ist damit 100 Mal schärfer als übliche Lichtmikroskope und 20 Mal besser als die bisher stärksten lichtmikroskopischen Methoden – etwa das von Hell entwickelte Sted und das Palm/Storm von seinem Nobelpreiskollegen Eric Betzig. Die Stärken beider Mikroskoptechniken vereinte Hell in einem völlig neuen Konzept – und schuf so die Möglichkeit, Leben auf molekularer Ebene zu beobachten. Zwar sind beispielsweise Elektronenmikroskope noch schärfer, doch herrscht in ihrem Inneren ein Vakuum, weshalb lebende Zellen in kürzester Zeit absterben. Sie taugen für diesen Zweck also nur bedingt.

„Mit Minflux erreichen wir Auflösungen von 1 nm, das ist der Durchmesser einzelner Moleküle – die ultimative Grenze dessen, was in der Fluoreszenzmikroskopie möglich ist“, sagt der Max-Planck-Direktor. „Ich bin überzeugt, dass Minflux-Mikroskope das Zeug dazu haben, eines der grundlegendsten Werkzeuge der Zellbiologie zu werden.“ Mit dem Verfahren lassen sich Zellen auf Molekülebene kartografieren und Vorgänge in ihrem Inneren in Echtzeit sichtbar machen.

Foto: Klaus Gwosch / Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Erstmals lassen sich Moleküle optisch erkennen, die nur Nanometer voneinander entfernt sind. Die Anordnung fluoreszierender Moleküle ist schematisch dargestellt (li.). Bei gleicher Helligkeit der Moleküle gelang bisher – etwa mit dem Palm/Storm-Mikroskop – nur ein diffuses Bild (re.). Mit dem Minflux-Mikroskop aber ist die Position der Moleküle (Mitte) klar auszumachen.

Was aber macht es so schwierig, Licht ins Innere von lebenden Zellen zu bringen? Im Jahr 1873 hatte der Physiker Ernst Abbe formuliert, dass die Auflösung von Lichtmikroskopen auf die halbe Wellenlänge des Lichts begrenzt ist – also auf etwa 200 nm. Dieses Limit behielt physikalisch lange seine Gültigkeit. Doch Hell zeigte als Erster mit der von ihm erdachten und 1999 experimentell umgesetzten Sted-Mikroskopie, dass sich die Grenze überwinden lässt.

Sted und das von Betzig entwickelte Palm/Storm erreichen eine Trennschärfe von 20 nm bis 30 nm – das ist zehn Mal besser als das Abbe-Limit. Beide Systeme trennen fluoreszierende Moleküle, indem sie sie nacheinander an- und ausschalten und so sequenziell aufleuchten lassen.

Allerdings unterscheiden sich die Methoden in einem wesentlichen Punkt. Die Sted-Mikroskopie setzt einen Donut-förmigen Laserstrahl ein, um das Leuchten der Moleküle an genau festgelegten Koordinaten in der Probe zu unterdrücken. Der Vorteil: Durch den definierten Donut-Strahl weiß man präzise, an welchem Punkt im Raum sich das gerade leuchtende Molekül befindet. Der Nachteil: Der Laserstrahl reicht nur aus, um ein einziges Molekül anzusteuern.

Beim Palm/Storm hingegen erfolgt das An- und Ausschalten Molekül für Molekül an zufälligen Orten – mit dem Vorteil, dass man bereits auf der Ebene einzelner Moleküle arbeitet, jedoch mit dem Nachteil, dass man deren genaue Position erst ermitteln muss. In der Praxis lässt sich damit routinemäßig aber keine molekulare Auflösung erreichen.

Was lag näher, als die Stärken beider Techniken zu verbinden? „Diese Aufgabe war alles andere als trivial“, gesteht Hell. Aber sie gelang. Auch Minflux schaltet einzelne Moleküle zufällig an und aus. Zugleich aber bestimmt es deren exakte Position mit einem Donut-förmigen Laserstrahl, der im Gegensatz zu Sted nicht dem Abregen, sondern dem Anregen der Fluoreszenz dient. Liegt das Molekül auf dem Donut-Ring, so leuchtet es; liegt es exakt in seinem dunklen Zentrum, so leuchtet es nicht, dafür aber hat man seine genaue Position gefunden.

Um diese Position mit höchster Präzision schnell bestimmen zu können, entwickelte Hells Mitarbeiter Francisco Balzarotti einen ausgeklügelten Algorithmus. „Damit konnten wir das volle Potenzial des Donut-Laserstrahls ausschöpfen“, erläutert der Nachwuchswissenschaftler am Göttinger Max-Planck-Institut. Und sein Kollege Klaus Gwosch, dem die Aufnahme der molekular aufgelösten Bilder gelang, ergänzt: „Es war ein unglaubliches Gefühl, als wir zum ersten Mal mit Minflux Moleküle auf der Skala von wenigen Nanometern unterscheiden konnten.“

Und das System bietet einen weiteren großen Vorteil: „Minflux ist im Vergleich zum Palm/Storm sehr viel schneller. Da die Technik mit dem Donut-Laserstrahl arbeitet, kommt sie mit wesentlich weniger Lichtsignal, das heißt: Fluoreszenz-Photonen, pro Molekül aus“, freut sich Hell.

Bereits mit Sted konnte man Echtzeitvideos aus dem Inneren lebender Zellen machen. Nun aber sei es möglich, die Bewegung von Molekülen in einer Zelle mit einer 100 Mal besseren zeitlichen Auflösung zu verfolgen, erklärt Hells Mitarbeiter Yvan Eilers. Er hat mit Minflux die Bewegung von Molekülen in einem lebenden E. coli-Bakterium in bisher unerreichter Zeitauflösung gefilmt. „Und bei der Geschwindigkeit haben wir die Möglichkeiten von Minflux noch längst nicht ausgereizt“, meint Eilers.

Die Wissenschaftler sind überzeugt, dass sich selbst extrem schnelle Abläufe in lebenden Zellen untersuchen lassen – etwa die Bewegung zellulärer Nanomaschinen oder die Faltung von Proteinen. Seit Anfang Februar wollen sie in einem vom Bundesforschungsministerium (BMBF) geförderten Projekt gemeinsam mit der Abberior Instruments GmbH in Göttingen durch Kombination verschiedener Mikroskoptechniken die Grundlagen für ein dreidimensional hochauflösendes Mikroskop für Lebendzellanwendungen erarbeiten.

Der Nutzen, der sich für die Forschung daraus ergibt, wäre enorm: Gelingt es, lebende Zellen mit einer Auflösung von 25 nm bis 50 nm in 3D abzubilden, könnten z. B. Hirnforscher auf der ganzen Welt dem Menschen beim Denken zuschauen.

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